Validierte Methode für monoklonale Antikörper-Medikamente
Bewertung der nSMOL-Methodik bei der Bevacizumab-Bestimmung in menschlichem Serum
Entwicklung und Validierung bioanalytischer Methoden für Proteine können durch die mangelnde Verfügbarkeit von Prüfreagenzien erschwert werden. LCMS/ MS-Analysen erlauben eine Herangehensweise, die allgemeinere Reagenzien nutzt. Bei solchen Analysen sind aber das Probenhandling sowie die Aufarbeitung der Proben entscheidende kritische Parameter für die nötige Selektivität und Empfindlichkeit der Messungen.
Die nSMOL-Techologie (nano-Surface and Molecular Orientation Limited Proteolysis) liefert einen einzigartigen Ansatz, um monoklonale Antikörper(IgGs)-Medikamente in biologischen Proben zu quantifizieren. Sie ermöglicht die selektive Proteolyse der FAB-Region im Antikörper mithilfe eines speziellen Protein-A-Bindungsharzes und Trypsin-immobilisierter Nanopartikel für den Proteinabbau.
| Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml) | 100 | 100 | 300 | 300 | 3.000 | 3.000 | 7.500 | 7.500 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Lauf # | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) |
| 1 | 97,1 | -2,90 | 276 | -8,00 | 2.540 | -15,3 | 7.110 | -5,20 |
| 1 | 91,2 | -8,80 | 264 | -12,0 | 2.910 | -3,00 | 6.960 | -7,20 |
| 1 | 88,1 | -11,9 | 306 | 2,00 | 3.030 | 1,00 | 8.370 | 11,6 |
| 1 | 105 | 5,00 | 276 | -8,00 | 2.910 | -3,00 | 7.660 | 2,13 |
| 1 | 90,2 | -9,80 | 238 | -20,7 | 2.860 | -4,67 | 7.850 | 4,67 |
| 1 | 79,1 | -20,9 | 292 | -2,67 | 3.110 | 3,67 | 8.030 | 7,07 |
| 2 | a | a | 302 | 0,667 | 2.800 | -6,67 | 6.970 | -7,07 |
| 2 | 107 | 7,00 | 311 | 3,67 | 3.170 | 5,67 | 7.370 | -1,73 |
| 2 | 132 | 32,0 | 271 | -9,67 | 2.720 | -9,33 | 6.990 | -6,80 |
| 2 | 117 | 17,0 | 286 | -4,67 | 2.720 | -9,33 | 7.020 | -6,40 |
| 2 | 111 | 11,0 | 297 | -1,00 | 2.910 | -3,00 | 6.580 | -12,3 |
| 3 | 108 | 8,00 | 281 | -6,33 | 2.740 | -8,67 | 6.740 | -10,1 |
| 3 | 118 | 18,0 | 289 | -3,67 | 2.750 | -8,33 | 7.610 | 1,47 |
| 3 | 104 | 4,00 | 292 | -2,67 | 2.500 | -16,7 | 7.780 | 3,73 |
| 3 | 86,4 | -13,6 | a | a | 3.070 | 2,33 | 4.560 b | -39,2 b |
| 3 | 98,5 | -1,50 | 254 | -15,3 | 2.840 | -5,33 | 7.590 | 1,20 |
| Mittelwert | 102 | 282 | 2.850 | 7.380 | ||||
| sd | 14,1 | 19,9 | 190 | 515 | ||||
| % CV | 13,8 | 7,05 | 6,65 | 6,98 | ||||
| % Dev | 2,17 | -5,89 | -5,04 | -1,66 |
Tabelle 1: Ergebnisse der Qualitätskontrolle für Bevacizumab in menschlichem Serum.
a = Keine nachgewiesene Antwort des Analyten. Probe wird verworfen.
b = Ausreißer per Dixon-Test; Wert fließt nicht in die statistische Berechnung ein.
Überprüfung der Methode mit einem Medikament zur Krebsbehandlung
Wissenschaftler von Shimadzu haben diese Technik getestet und erfolgreich eine validierte Methode für diverse monoklonale Antikörper-Medikamente entwickelt [1, 2]. Als Teil einer unabhängigen Methodenüberprüfung beurteilte das kalifornische Auftragsforschungsunternehmen Intertek Pharmaceutical Services die Technik und validierte eine LC-MS/ MS-Methode für Bevacizumab mithilfe eines Validierungsprotokolls, das mit industriellen Standards und den Regulierungsstandards für pharmazeutische Wirkstoffkandidaten übereinstimmt [3, 4]. Bevacizumab ist ein Medikament zur Behandlung zahlreicher Krebsvarianten.
Um den Nutzen der nSMOLTechnik zu beurteilen, wurde die LC-MS/MS-Analyse von Bevacizumab in menschlichem Serum über den Bereich einer Standardkonzentration von 100 ng/ml bis 10.000 ng/ml entwickelt. Zunächst wurde hierbei dem Standard- Probenbearbeitungsprotokoll gefolgt, das den internen Standard des Kit-Systems verwendet. So wurden bereits Ergebnisse mit hinreichender Genauigkeit und Präzision erreicht. Für die intern entwickelte Chromatographie-Methode ergab der analoge interne Standard allerdings untypische Messergebnisse bei hohen Analyt-Konzentrationen in eingefrorenen QC-Proben.
Geeignet für eine rasche Methodenentwicklung?
Im nächsten Schritt wurde die Methode auf eine 96-well-Mikrotiterplatten-Methode optimiert. Hierzu wurde ein stabil peptidmarkierter interner Standard verwendet. Die Optimierung sollte den Probendurchsatz, die Selektivität und die Leistungsfähigkeit der Methode verbessern. Wesentliche Veränderungen an den entscheidenden Protokollschritten des Shimadzu-Protokolls wurden nicht vorgenommen. Hierbei sollte festgestellt werden, ob sich das nSMOL Kit-System eignet, um rasch Methoden ohne aufwendige Optimierung zu entwickeln.
Bei Verwendung von 10 μl Serum wurde die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ = lower limit of quantification) mit einem soliden Signal-Rausch-Verhältnis (>20:1 S/N) beobachtet. Die Probenaufarbeitung auf ein 96-well-Mikrotiterplatten-Format umzusetzen, erforderte eine Methodenänderung bei der Aliquotgröße, aufgrund eines unbekannten Empfindlichkeitsabfalls. Hierbei wurden 10 μl als ein mehr als akzeptables Probenvolumen angesehen.
Die Leistungsfähigkeit der Analyse bezüglich der Standardabweichung im Verlauf der Validierung war hinreichend und lag deutlich unterhalb des ± 20 % Akzeptanzkriteriums (Tabelle 1). Interassay-Abweichungen wurden mit prozentualen Werten im Bereich von -5,89 % bis -1,66 % (2,17 % beim LLOQ) und Interassay-Präzisionswerten bei ≤ 7,05 % (13,8 % beim LLOQ) bestimmt. Die Signalintenstät von Blankproben lag in allen Fällen unterhalb von 20 % des LLOQ-Wertes, was eine hinreichende Selektivität zeigt.
| Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml) | 300 | 300 | 7.500 | 7.500 |
|---|---|---|---|---|
| Charge # | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) | Gefundene Menge (ng/ml) | Dev. (%) |
| Charge1 | 340 | 13,3 | 8.160 | 8,80 |
| Charge 2 | 393 | 31,0 | 8.680 | 15,7 |
| Charge 3 | 351 | 17,0 | 8.620 | 14,9 |
| Charge 4 | 225 | -25,0 | 5.540 | -26,1 |
| Charge 5 | 326 | 8,67 | 7.350 | -2,00 |
| Charge 6 | 342 | 14,0 | 8.110 | 8,13 |
| Mittelwert | 330 | 7.740 | ||
| sd | 56,0 | 1.180 | ||
| % CV | 17,0 | 15,2 | ||
| % Dev | 9,83 | 3,24 | ||
| A.V. | 4/6 | 5/6 |
Tabelle 2: Matrixeffekte für Bevacizumab in einzelnen Anteilen menschlichen Serums. A.V. = Akzeptanzverhältnis
Keine wesentlichen Matrixeffekte
Eine möglichst geringe Matrixbelastung ist für jede LC-MS/MS-Analyse sehr wichtig. Bei dieser Validierung wurden niedrig- und hochkonzentrierte Qualitätskontrollproben (QC) aus sechs unterschiedlichen Serumchargen menschlichen Serums angefertigt und zum Vergleich ebenso aus einem hyperlipämischen und einem hämolytischen Serum. Die Wahl der QC-Bewertungen unter Berücksichtigung unterschiedlicher Matrices lag darin begründet, einen strengeren Ansatz im Falle der nSMOL-Bewertung zu testen, da die unterschiedlichen Matrices in den QC-Proben sich bei der Probenaufarbeitung und dem Trypsinabbau unterschiedlich auswirken können und zudem bei der massenspektrometrischen Analyse durch Ionensuppression- oder Verstärkungseffekte zu Abweichungen der Messergebnisse führen können.
Bei den Experimenten zum Matrixeffekt lagen mindestens zwei Drittel der einzelnen Chargen innerhalb von 20 % der Nennkonzentration und die mittlere Gesamtkonzentration lag ebenfalls innerhalb 20 %, was darauf hinweist, dass keine wesentlichen Matrixeffekte vorhanden waren (Tabelle 2). Zusätzlich lagen sowohl die hämolytischen als auch die hyperlipämischen QC-Chargen innerhalb der 20 %-Abweichung der Nennkonzentration (Abbildung 3). Da einige individuelle Chargen außerhalb der 20 % lagen, und da es auch in den gemessenen Konzentrationen der hyperlipämischen Charge einen Ausreißer gab, könnten weitere chromatographische Anpassungen oder Modifikationen bei der Probenaufarbeitung hilfreich sein, um die Leistungsfähigkeit der Methode zusätzlich zu verbessern.
| Konzentrationen der Qualitätskontrolle (ng/ml) | 300 | 300 | 7.500 | 7.500 |
|---|---|---|---|---|
| Probentyp | Konz. (ng/ml) | Dev. (%) | Konz. (ng/ml) | Dev. (%) |
| Hyperlipämisches Serum | 373 | 24,3 | 8.670 | 15,6 |
| Hyperlipämisches Serum | 342 | 14,0 | 8.550 | 14,0 |
| Hyperlipämisches Serum | 346 | 15,3 | 8.450 | 12,7 |
| Mittelwert | 354 | 8.560 | ||
| sd | 16,9 | 110 | ||
| % CV | 4,77 | 1,29 | ||
| % Dev | 17,9 | 14,1 | ||
| Hämolisiertes Serum | 301 | 0,333 | 7.810 | 4,13 |
| Hämolisiertes Serum | 252 | -16,0 | 7.610 | 1,47 |
| Hämolisiertes Serum | 276 | -8,00 | 7.420 | -1,07 |
| Mittelwert | 276 | 7.610 | ||
| sd | 24,5 | 195 | ||
| % CV | 8,87 | 2,56 | ||
| % Dev | -7,89 | 1,51 |
Tabelle 3: Matrixeffekte für Bevacizumab in hämolysierten und hyperlipämischen Anteilen menschlichen Serums
Fazit
Insgesamt erzielte die nSMOL-Methode mit einer nur minimalen Anpassung des Standardverfahrens eine hinreichende Leistungsfähigkeit bei der Validierung der Bestimmung von Bevacizumab in menschlichem Serum. Der Einsatz von nSMOL in verschiedenen Laboren, könnte eine individuelle Anpassung rechtfertigen und es wird wie bei jeder LC-MS-Analytik die Verwendung stabil markierter interner Standards ausdrücklich empfohlen.
nSMOL ist eine Marke der Shimadzu Corp.
Autoren
Michael H. Buonarati, Ph.D., Senior Director
Dale Schoener, Scientific Director
Intertek Pharmaceutical Services
Referenzen
[1.] Iwamoto N., Umino Y., Aoki C., Yamane N., Hamada A., Shimada T. Fully validated LC-MS bioanalysis of Bevacizumab in human plasma using nano-surface and molecular-orientation limited (nSMOL) proteolysis. Drug Metab Pharmacokinet. 31 (2016), 46-50.
[2.] Iwamoto N., Takanashi M., Umino Y., Aoki C., Hamada A., Shimada T. Application of nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis to LC-MS bioanalysis of Cetuximab. Bioanalysis. 8 (2016), 1009-20.
[3.] Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, May 2018.
[4.] Jenkins R., Duggan JX., Aubry AF., Zeng J., Lee JW., Cojocaru L., Dufield D., Garofolo F., Kaur S., Schultz GA., Xu K., Yang Z., Yu J., Zhang YJ., Vazvaei F. Recommendations for validation of LC-MS/MS bioanalytical methods for protein biotherapeutics. AAPS J. 17 (2015), 1-16.