Massenspektrometrische Bestimmung von Mykotoxinen in Weihnachtsgebäck
Draußen ist es dunkel, kalt und nass, drinnen dagegen gemütlich und warm. Passend dazu gibt es frischen Kaffee oder Tee und hausgemachte Plätzchen. Aber so wohltuend das leckere Gebäck zu dieser ungemütlichen Jahreszeit auch ist, so kann es unsichtbare Gefahren in sich bergen: Schimmelpilzgifte – auch bekannt als Mykotoxine. Neben Getreide-Produkten finden sich Mykotoxine häufig in Kokosnüssen, Mandeln, Milchprodukten, Gewürzen oder in Obst und Kakao. Ein sehr häufig gefundener Vertreter der Gifte ist das Aflatoxin – insbesondere auf fettreichen Gemüseprodukten wie Nüssen, Mandeln und Mais.
Andere Mykotoxine, wie bspw. Ochratoxin A, Fumonisine, Deoxynivalenol und Zearalenon, werden öfter in Getreideprodukten oder auch in Mais nachgewiesen.
Was genau sind Mykotoxine?
Mykotoxine sind sekundäre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen. Sie besitzen unterschiedliche chemische Strukturen, sind unsichtbar und geruchslos. Aufgrund ihrer Hitzebeständigkeit zerstören sie weder das Braten, Kochen, noch Backen. Das Abschneiden verschimmelter Bereiche hilft nicht, da sich Pilze unsichtbar ausbreiten. Angeschimmelte Zutaten oder Waren sollten weder verzehrt noch verarbeitet werden.
Die Schimmelpilzgifte bergen eine Reihe von Gefahren und können zu unterschiedlichen Krankheiten bei Menschen führen. Mykotoxine beeinträchtigen nicht nur das Immunsystem oder verursachen Durchfall und Erbrechen, sie lösen auch Krebs aus und schädigen Nieren und Leber. Neben den Antibiotika zählen die Mykotoxine zu der größten Gruppe der aktiven Substanzen, die durch Pilze synthetisiert werden. Die Mykotoxin bildenden Schimmelpilze sind weltweit vertreten. Toxine bestimmter höherer Pilze, wie z. B. dem Knollenblätterpilz, zählen nicht zu den Mykotoxinen im engeren Sinn.
Kontamination und Übertragung von Mykotoxinen
In der Regel begünstigen etwa feuchtes und warmes Klima die Wachstumsbedingungen der Mykotoxine. Es wird hierbei zwischen primärer und sekundärer Kontamination unterschieden.
Die primäre Kontamination beschreibt den direkten Befall der Pflanzen auf dem Feld mit dem sogenannten Feldpilzen (Fusarium). Dieser verursacht Krankheiten der Pflanzen und einem damit verbundenen niedrigen Ernteertrag. Bei einer sekundären Kontamination kann eine ungünstige Lagerung zu einem Schimmelpilzbefall durch sogenannte Lagerpilze führen (Aspergillus- und Penicillium- Arten).
Eine sekundäre Kontamination findet bei Backzutaten oder bereits fertigen Lebensmitteln häufig durch falsche oder zu lange Lagerung statt. Diese ist oftmals an dem bekannten Schimmel-Wachstum erkennbar. Weiterhin gelangen Mykotoxine (teilweise in metabolisierter Form) durch Verschleppung über kontaminierte Futtermittel oder Nutztiere in Lebensmittel wie Fleisch, Eier und Milchprodukte.
Grenzwerte definiert
Da sich Futter- oder Lebensmittel, die mit Mykotoxinen belastet sind, nachträglich nicht mehr reinigen lassen und dementsprechend unbrauchbar sind, muss der Pilzbefall und damit das Verschimmeln von vornherein verhindert werden. Hierfür soll die Einhaltung einer guten landwirtschaftlichen Praxis sowie einer guten Herstellungspraxis Sorge tragen. Die Endverbraucher müssen zusätzlich darauf achten, die Lebensmittel trocken und kühl zu lagern. Beispielsweise verfärbte Nüsse mit unangenehmem Geruch sollten nicht mehr verzehrt werden. Oft hilft auch das Abschneiden verschimmelter Bereiche des betroffenen Lebensmittels nicht, da der Pilz sich schon unsichtbar ausgebreitet hat. Solche angeschimmelten Zutaten oder Waren sollten nicht mehr verzehrt oder verarbeitet werden.
Aufgrund des Risikos der Mykotoxine, haben neben der Europäischen Union (EU) auch viele andere Länder Grenzwerte definiert. Die EU hat die Limits bestimmter Kontaminationen in Nahrungsmitteln durch die Regulierung der EU-Kommission festgelegt (Verordnung [EC] Nr. 1881/2006 und Ergänzungen). Beispielsweise für Aflatoxin in Nüssen liegt das Maximum bei 2 μg Aflatoxin B1 je kg und bei 4 μg für die Gesamtsumme von Aflatoxin B und G je kg in Brot, Backwaren und Keksen.
Daher ist es wünschenswert, so viele Mykotoxine wie möglich in nur einer einzigen analytischen Methode zu bestimmen – unabhängig von Konzentrationsbereich und Probenmatrix. Eine solche Multi-Komponenten-Analyse lässt sich durch die Verwendung eines LC/MS-Triple-Quadrupol-Systems durchführen. Hierbei isoliert und fragmentiert ein Massenspektrometer nach chromatographischer Trennung die gesuchten Analyten und analysiert die resultierenden Fragment-Ionen.
Tabelle 1: Methodenparameter LCMS-8060
| UHPLC-System | Nexera X2 LC-System |
|---|---|
| Trennsäule | Mastro PFP (100 mm x 2,1 mm; I.D. 3 µm) |
| Ofentemperatur | 40°C |
| Flussrate | 400 µl/min |
| Mobile Phase A | Wasser + 0,15 mmol/ml Ammoniumfluorid |
| Mobile Phase B | Methanol + 0,15 mmol/ml Ammoniumfluorid + 2% Essigsäure |
| Binärer Gradient | Mobile Phase Konzentration 15% (0 min); 25% (1 min); 40% (2 min); 41% (4,5 min); 100% (7,5 - 10 min); 15% (10,1 min); Stop (12,5 min) |
| Massenspektrometer | Shimadzu LCMS-8060 |
|---|---|
| Trennsäule | Mastro PFP (100 mm x 2,1 mm; I.D. 3 µm) |
| Pause Time / Dwell Time | 1 msec / 10 - 40 msec |
| Polaritätswechsel | Pos/Neg innerhalb von 5 msec |
| Quellentemperatur (Interface, Heat Block, DL) | 300°C, 400°C, 250°C |
| Gasflüsse (Nebulising, Heating, Drying) | 3 l/min, 10 l/min, 10 l/min |
Sensitive Detektion von Mykotoxinen mittels LC/MS
Das folgende Anwendungsbeispiel zeigt eine Möglichkeit, den Gehalt fast aller relevanten Mykotoxine aus Inhaltsstoffen von Backwaren innerhalb einer analytischen Methode zu bestimmen. Im Falle von Desoxynivalenol, muss aufgrund der Polarität des Moleküls eine modifizierte Extraktionsmethode durchgeführt werden.
Eine Festphasenextraktions (SPE)-Methode vereinfacht die Probenvorbereitung. 5 g der gemahlenen Probe (Nüsse, Mandeln, Mehl, etc.) wurden gemischt. Zu diesem Gemisch wurden 20 ml Wasser/Acetonitrils (50/50 v/v) hinzugegeben und die Probe anschließend für 5 min im Ultraschallbad behandelt. Danach wurde sie für weitere 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bevor ein Teil des Überstands nach Zentrifugation weiterbearbeitet wurde. Der Überstand wurde hierzu mit Wasser verdünnt in eine Festphasen-Kartusche (Isolute Myco, Biotage, Cardiff, Großbritannien) übertragen, gewaschen und mit Lösungsmittel eluiert. Das Eluat wurde vollständig getrocknet und mit 300 μl einer 20 %igen Acetonitril/ Methanol + 0,1 % Ameisensäure-Lösung rekonstituiert. Vor der Injektion der Probe in das LC/MS-System wurde diese durch einen 0,45 μm PTFE-Filter filtriert.
Zur Analyse der extrahierten Substanzen diente eine Nexera X2 UHPLC-Anlage gekoppelt mit einem hochsensitiven LCMS-8060 Triple- Quadrupol-Massenspektrometer von Shimadzu (Abb. 2). Die eingesetzte Mastro PFP-Chromatographiesäule ist aufgrund ihrer internen Struktur in der Lage, auch bei chelatbildenden Substanzen, wie dem Fumonisin, eine hervorragende Signalform zu erzeugen. Die beschriebene Methode erfüllt die von der EU-Verordnung geforderten Grenzwerte für die analysierten Mykotoxine problemlos.
Analyse von Realproben
16 kommerzielle Proben von verschiedenen Backzutaten (Weizenmehl, Dinkelmehl, Haferflocken, Mandeln, Haselnuss, Erdnuss, Walnuss und Cashew-Nuss) aus verschiedenen lokalen Quellen wurden auf gängige Mykotoxine untersucht. In einigen Beispielen ließen sich Mykotoxine nachweisen (Tabelle 1). Zwei Stichproben überschritten sogar die festgelegten Maximalwerte der EU.
Zusätzlich wurde bei der Analytik der so genannte „MRM-Spektrum-Modus“ verwendet. Dabei lassen sich nicht, wie sonst üblich, nur zwei Fragmente der Zielanalyten bestimmen, sondern eine höhere Anzahl (typischerweise 6-10) von MRM-Fragment-Ionen. Mit diesem MRM-Spektrum-Modus wird eine konventionelle MRM-Quantifizierung mit einem hochwertigen MRM-Produkt-Ionenspektrum kombiniert. Der große Vorteil dieser Vorgehensweise liegt in einer deutlich erhöhten Selektivität bezüglich der gesuchten Zielsubstanzen, die zudem eine zusätzliche qualitative Überprüfung der Ergebnisse über eine Bibliothekensuche ermöglicht (Abb. 3 und 4).
Tabelle 2: Mess-Ergebnisse in μg/kg aller untersuchten Proben; rot dargestellte Ergebnisse überschreiten die zulässigen Höchstmengen.
| Probe 1 Mandel | Probe 2 Mandel | Probe 3 Walnuss | Probe 4 Walnuss | Probe 5 Erdnuss | Probe 6 Haselnuss | Probe 7 Cashew | Probe 8 Weizenmehl | Probe 9 Weizenmehl | Probe 10 Weizenmehl | Probe 11 Weizenmehl | Probe 12 Dinkelmehl | Probe 13 Dinkelmehl | Probe 14 Haferflocken | Probe 15 Haferflocken | Probe 16 Haferflocken | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Aflatoxin B1 | < L0Q | 0,31 | - | - | - | 1,65 | < L0Q | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Aflatoxin B2 | - | - | - | - | - | 0,46 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Aflatoxin G1 | - | - | < L0Q | < L0Q | - | 2,74 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Aflatoxin G2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Summe Aflatoxine | - | 0,31 | - | - | - | 4,85 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Ochratoxin A | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | < L0Q | 0,14 | < L0Q |
| Fumosinin B1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Fumosinin B2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| HT-2 Toxin | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 9,80 | 24,59 | 6,01 |
| T-2 Toxin | - | - | - | - | - | 2,39 | - | - | - | - | - | - | 5,70 | 3,32 | 23,05 | 2,80 |
| Zearalenon | - | - | - | - | - | < L0Q | - | < L0Q | < L0Q | 6,35 | - | < L0Q | - | < L0Q | < L0Q | < L0Q |
Fazit
Für die Lebensmittelsicherheit ist zunächst der Hersteller verantwortlich, der durch Eigenkontrollen sicherstellen muss, dass von dem produzierten Lebensmittel keine negativen Auswirkungen auf die Gesundheit des Verbrauchers ausgehen. Die Überwachung beginnt dabei bei den Rohstoffen und soll sicherstellen, dass kontaminierte Lebensmittel nicht in Umlauf gelangen. Um eine maximale Sicherheit zu gewährleisten, sind schnelle und empfindliche Messmethoden zur gleichzeitigen Untersuchung vieler Komponenten essenziell und aus der Lebensmittelanalytik heutzutage nicht mehr wegzudenken. Trotzdem ließen sich in einigen der getesteten Zutaten entsprechende Kontaminationen an Mykotoxinen feststellen. Zwei der Proben überschritten sogar die geltenden Grenzwerte. Trotz dieser Ausnahmen sollten alle Gebäckliebhaber weiterhin ihren Spaß am Backen bewahren und die eigenen Kekse mit Genuss verzehren. Sollte durch übermäßigen Konsum eine gesundheitliche Gefährdung vorliegen, dann ist diese ebenfalls auf eine zu erwartende Gewichtszunahme zurückzuführen.
Autor: Dipl.-Ing. Julian Elm, Produktspezialist LCMS, Shimadzu Deutschland