Methode zur Analyse mehrerer COVID-19-Medikamente durch LC-MS/MS

Einführung

Die COVID-19-Pandemie beschleunigte den Einsatz von Medikamenten zur Behandlung von Patienten weltweit. Der Mangel an Wissen über Konzentration und Pharmakokinetik ist ein Problem, um die richtige Dosis vorzuschlagen. Die Shimadzu-Tochter ALSACHIM hat eine LC-MS/MS-Methode zur Überwachung dieser Medikamente (Favipiravir, GS 441524, Remidesivir, Hydroxychloroquin, Desethychloroquin, Chloroquin) entwickelt und stellt sie hier vor, Azithomcyin, Ritonavir, Lopinavir), die in mehr als 50% der weltweit bei COVID-19-Patienten durchgeführten klinischen Tiralen eingesetzt wurden.

Methoden

HPLC-BedingungenMS-Bedingungen
Analytische SäuleC18 2.1x50mm, 5µmIonisierungESI Positiv
Mobile Phase AH20 + 0,1% AmeisensäureDL-Temperatur200°C
Mobile Phase BMeOH + 0,1% AmeisensäureWärmeblock-Temp.300°C
Flussrate0,5 mL/minInterface-Temp.250°C
Ofentemperatur30°CZerstäubergasfluss2 L/min
Trocknungsgasfluss10 L/min
Heizgasfluss10 L/min

Probenvorbereitung

Diese Methode umfasst 9 Analyten (Favipiravir, GS 441524, Remdesivir, Hydroxychloroquin, Desethylchloroquin, Chloroquin, Azithromcyin, Ritonavir, Lopinavir) und ihre entsprechenden stabilen isotopmarkierten Standards.

Die Proben werden wie folgt vorbereitet:
1) 50 µL Plasmaprobe in 1,5 mL Mikroröhrchen geben
2) 200 µL MeOH mit internem Standard hinzufügen
3) Vortex 1 min
4) Zentrifuge 7 min bei 15.000 g
5) Den Überstand mit mobiler Phase A verdünnen: 100 µL der mobilen Phase A in ein Fläschchen mit Einsatz geben und 50 µL des Überstands hinzufügen (Verdünnungsfaktor vor der Analyse kann erhöht werden).

Injektionsvolumen: 1 µL (abhängig von der Empfindlichkeit des Massenspektrometers)

Die behandelten Proben wurden durch eine analytische Säule bei 30°C innerhalb von 6 Minuten getrennt. Das Gradientenprogramm wird in Tabelle 1 beschrieben. Als Geräte wurden die Shimadzu Nexera X2 und das LCMS-8050 mit Elektrospray-Ionisierung im positiven Ionenmodus genutzt. Parameter für die Überwachung von Mehrfachreaktionen (MRM) sind in Tabelle 2 dargestellt.

Zeit (Min)Ereignis%
0.00Pumpe B Konz.1
3.00Pumpe B Konz.99
4.00Pumpe B Konz.99
4.50Pumpe B Konz.1
6.00Stop-

Tabelle 1: Gradientenprogramm

MoleküleRef.Übergänge MRM (1)Übergänge MRM (2)
FavipiravirC8720158,20>113,10158,20>85,10
GS 441524C8847292,00>163,10292,00>147,10
RemdesivirC8799603,20>200,10603,20>402,20
HydroxylchloroquinC4600336,10>247,15336,10>179,10
DesthylchloroquinC2331292,10>179,05292,10>114,20
ChloroquinC1741320,10>247,15320,10>142,20
AzithromycinC1746749,40>591,50749,40>158,20
RitonavirC2792721,20>296,25721,20>228,25
LopinavirC2745629,30>155,15629,30>447,30
[13C, 15N]-FavipiravirC8853160,00>113,10160,00>85,10
[13C5]-GS 441524C8855297,20>164,10297,20>148,10
[U-Ring-13C6]-RemdesivirC8854609,20>206,20609,20>408,35
[2H5]-HydroxylchloroquinC6422341,30>247,20341,30>179,20
[2H5]-DesthylchloroquinC2453297,10>179,20297,10>119,20
[2H5]-ChloroquinC5023325,15>247,20325,15>147,25
[13C, 2H3]-AzithromycinC1768753,50>595,50753,50>158,25
[13C, 2H3]-RitonavirC2963725,35>300,20725,35>272,20
[2H8]-LopinavirC4693637,35>163,30637,35>447,35

Ergebnisse

Wir führten gleichzeitige Analysen über einen Konzentrationsbereich von bis zu 2.000 ng/mL für 7 Moleküle und bis zu 10.000 ng/mL für Ritonavir und Lopinavir durch. Die erstellten Kalibrierkurven wiesen für jede Kurve lineare Regressionswerte von r2>0,99 auf. Die CV%-Werte der Konzentration lagen innerhalb akzeptabler analytischer Bereiche (<15%).

Alsachim_Applikation

Schwarzer Peak: unmarkierte Verbindung
Roter Peak: markierte Verbindung (für Remdesivir ist die markierte Verbindung eine Mischung von Diastereoisomeren)

FavipiravirGS 441524Remdesivir
Konzentration (ng/mL)501001.000501001.000251001.000
Durchschnitt (ng/mL)49,899,81.092,547,699,61.035,223,197,8988,9
CV (%)4,48,65,910,66,94,64,13,71,9
Abweichung-0,5-0,29,3-4,9-0,43,5-7,5-2,2-1,1
HydroxylchloroquinDesethylcloroquinChloroquin
Konzentration (ng/mL)251001.000501001.000251001.000
Durchschnitt (ng/mL)24,496,61.003,047,695,2949,224,295,6963,2
CV (%)3,63,02,44,42,25,63,33,01,8
Abweichung-2,5-3,40,3-4,7-4,8-5,1-3,2-4,4-3,7
AzithromycinRitonavirLopinavir
Konzentration (ng/mL)251001.0001005001.0001005001.000
Durchschnitt (ng/mL)24,997,2962,298,3498,6891,392,1503,7917,2
CV (%)6,62,52,03,22,03,12,00,81,3
Abweichung-0,6-2,8-3,8-1,7-0,3-10,9-7,90,7-8,3

Abbildung 1: Kalibrierkurven, MRM-Chromatogramme (bei Kalibratorstufe 1) und Zusammenfassung der Wiederholbarkeit

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