Quantifizierung von Isothiazolinonen als biozide Konservierungsstoffe in Wandfarben
Für die Konservierung von wässrigen Innenraumfarben werden in der Regel biozide Topfkonservierungsmittel eingesetzt, um eine ausreichende Stabilität der Farben und Gebinde zu gewährleisten. Da die Umwelt- und Gesundheitsverträglichkeit von Produkten für den Endverbraucher immer wichtiger werden, können Hersteller von wässrigen Innenraumfarben ihre Produkte durch die Jury Umweltzeichen (Blauer Engel) des Umweltbundesamtes beurteilen lassen und so die besondere Verträglichkeit für Umwelt und Gesundheit nachweisen.
Im Dezember 2018 wurden durch die Jury Umweltzeichen neue Vergaberichtlinien für die Vergabe des Blauen Engel Umweltzeichens für Konservierungsstoffe in wässrigen Innenraumfarben definiert [1]. Die wichtigste Neuerung in dieser Richtlinie ist, dass nach einer Übergangszeit die Innenwandfarben ab dem 31.12.2020 nicht mehr mit bioziden Konservierungsstoffen konserviert werden dürfen. Diese Vorgaben müssen durch den Hersteller mit Hilfe von analytischen Methoden belegt werden. Um nach diesen Kriterien noch eine Wandfarbe als „konservierungsmittelfrei“ deklarieren zu können, muss die Konservierungsmittelkonzentration bezogen auf die Einzelsubstanz einschließlich Formaldehyd auf 2 ppm begrenzt werden.
Eine Sonderrolle nehmen hierbei 2-Methyl-2H-isothiazolin-3-on (MIT), 5-Chlor-2-methyl-2H-isothiazolin-3-on (CIT) ein, deren Konzentration bei maximal 1,5 ppm (MIT) und 0,5 ppm (CIT) liegen darf.
Um diesen neuen Anforderungen gerecht zu werden, stellen wir Ihnen in dieser Applikationsnote eine neue Methode zur schnellen Trennung und empfindlichen Detektion der drei Konservierungsstoffe MIT, CIT und 1,2-Benzisothiazolin-3-on (BIT) vor. Durch die verbesserte Trennleistung können falsch positive Befunde und falsche Mehrbefunde durch schlecht abgetrennte Matrixinhaltsstoffe vermieden werden.
Probenvorbereitung und Messmethode
Nach [1] wird die zu analysierende Probe mit Methanol versetzt und auf einem Magnetrührer homogenisiert. Anschließend wird die Suspension zentrifugiert und der Überstand über einen Spritzenvorsatzfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert. Die Einwaage und die zum Suspendieren verwendete Menge an Methanol richten sich nach den Produkteigenschaften. Die Quantifizierung erfolgt jeweils in Doppelbestimmung über die Methode des externen Standards. In der Praxis hat sich eine Fällung der Dispersion vor Zentrifugation/Filtration mit 2.5%iger Aluminiumsulfat-Lösung bewährt. Es wird empfohlen, für die HPLC-Analyse eine Vorsäule oder einen Inlinefilter zu verwenden, um ein Verstopfen der Hauptsäule zu verhindern und die Lebensdauer der Säule zu verlängern.
| System | Nexera-i 3D plus |
| Säule | Shim-Pack Velox C18 3μm, (50 mm x 4.6 mm I.D) |
| Vorsäule | Velox EXP Guard 5 mm x 2.1 mm I.D. |
| Säulentemp. | 35°C |
| typischer Rückdruck | 210 bar (neueSäule) |
| Mobile Phase | A: wässrige Lösung von Phosphorsäure 85% pH 2,5 B: Acetonitril |
| Gradient | Start bei 5% B, 0.5 min 15% B, 3.5 min 15% B, 3.6 min 5% B, 5.0 min 5% B (Stop) |
| Detektion | UV (MIT, CIT) 275 nmUV (BIT) 318 nm |
| Flussrate | 0.6 ml/min |
| Inj. Volumen | 5 μl |
| Analysendauer | 5 min |
Optimierung der stationären Phase für eine verbesserte Peakform
Um schmalere Peaks für die Analyten MIT, CIT und BIT zu erhalten, wurde eine Shim-pack Velox RP-C18 Säule (2,7 μm Partikelgröße) eingesetzt und mit einer Standard RP-C18 Säule mit (3 μm Partikelgröße) verglichen. In Abbildung 1 ist sehr gut zu erkennen, dass durch das Coreshell-Material der Velox Säule die Peakbreite deutlich verringert werden kann. Dies hat den Vorteil, dass die Empfindlichkeit der Methode gesteigert und einer möglichen Überlappung durch Matrixpeaks vorgebeugt wird.
Abbildung 1: Vergleich zwischen konventionellem (schwarz) und Coreshell-Säulenmaterial (pink)
Verbesserung der Peakformdurch Co-Injektion
Durch die hohe Elutionskraft des Methanolin der injizierten Probe weisen frühe luierende Peaks wie das MIT verbreiterte Peakform auf. Dies kann durch eine Co-Injektion der Probe mit 1 μL Wasser umgangen werden. Hierdurch wird das Verteilungsgleichgewicht zum Zeitpunkt der Probenaufgabe kurzfristig zur stationären Phase hinverschoben, wodurch der Peak verschlankt und die Abtrennung des MIT von früh eluierenden Matrixbestandteilen nochmals verbessert wird (vgl. Abbildung 2).
Abbildung 2: Vergleich mit (schwarz) und ohne (pink) Co-Injektion
Abbildung 3: Einstellung der Co-Injektion mit der i-Series Plus in der LabSolution Software
Das Hilfsmittel der Co-Injektion kann einfach durch die grafisch aufgearbeitete Benutzeroberfläche in der LabSolution Software umgesetzt werden (vgl. Abbildung 3) und ist serienmäßig in der i-Series und in der Nexera LC-40-Serie vorhanden.
Quantifizierung von MIT, CIT und BIT
Die Quantifizierung und der lineare Bereich für die drei Konservierungsstoffe MIT, CIT und BIT sind in der Abbildung 4 aufgeführt. DieKalibrationsbereiche schließen für alle 3 Analyten die erlaubte Maximalkonzentration ein. Das Bestimmtheitsmaß für die Kalibrationsgeraden der drei Standards liegt bei mindestens 0,999.
Ergänzung um weitere relevante Analyten
Eine weitere Verbindung, die in wässrigen Innenraumfarben Anwendung findet ist Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol). Bei Verwendung eines Photodiodenarray-Detektors kann diese Verbindung bei 210 nm neben MIT, CIT und BIT in einer Probe detektiert werden. Abbildung 5 zeigt die Position des Bronopol-Peaks relativ zu MIT, CIT und BIT.
Abbildung 5: Retention von Bronopol im Vergleich zu MIT, CIT und BIT
Zusammenfassung
In der vorgestellten Applikationsnote wird die empfindliche und schnelle Analyse der Analyten MIT, CIT und BIT beschrieben. Die chromatographische Trennung der Verbindungen ist sehr gut und ein chromatographischer Lauf benötigt nur 5 Minuten. Die verwendeten Coreshell-Säulenmaterialien erlauben die Aufgabe von geringeren Probenmengen als für konventionelle Säulenmaterialien benötit wird und führen zu einer Verschlankung der Peaks. Die Technik der Co-Injektion bewirkt eine zusätzliche verbesserte Abtrennung früh eluierender Peaks wie MIT von der Matrix. Die Kalibration der Analyten im geforderten Konzentrationsbereich konnte erfolgreich demonstriert werden. Zusätzlich ist auch eine Erweiterung der Methode mit weiteren gebräuchlichen Bioziden möglich.
Quellen
[1] RAL gGmbH, Emissionsarme Innenwandfarben, DE-UZ 102, Vergabekriterien, Ausgabe Januar 2019,Version 2, Download: https://produktinfo.blauer-engel.de/uploads/criteriafile/de/DE-UZ%20102-201901-de%20Kriterien.pdf, (Aufruf 31.03.2020)