Quantitative Bestimmung von Acrylamid in Getreide mit dem Nexera X2 UHPLC-System
Acrylamid AA (C3H5NO) ist eine bekannte genotoxische Verbindung und wurde als krebserregend für den Menschen eingestuft.
AA ist in vielen verschiedenen Lebensmitteln wie Kaffee, Kartoffelchips, weichem/knusprigem Brot, Keksen und Cerealien enthalten.
In einer Vielzahl von veröffentlichen Studien konnte festgestellt werden, dass AA während des Bräunungsprozesses durch die Maillard-Reaktion von reduzierenden Zuckern mit Asparagin bei Temperaturen über 120 °C entsteht. Aufgrund seiner toxischen Eigenschaften hat die Europäische Kommission beschlossen Gesetze einzuführen, welche Konzentrationsobergrenzen von AA in Lebensmitteln festlegen.
Um die Konzentration von AA in Lebensmitteln zu bestimmen gibt es eine Reihe von unterschiedlichen Analysenmethoden. Am häufigsten werden die Flüssigchromatographie (HPLC) mit UV-Absorptionsdetektor sowie die Gaschromatographie (GC) mit Elektroneneinfangdetektor (ECD) und Massenspektrometer (MS) Detektor für die Analyse von AA eingesetzt.
In diesem Applikationsbericht wird eine zuverlässige, empfindliche, schnelle und kostengünstige Analysemethode (nur Wasser als Lösungsmittel) für die Bestimmung von Acrylamid in verarbeiteten Lebensmitteln auf Getreidebasis vorgestellt.
Analytische Methode
Das für diese Analyse verwendete Gerät ist ein Nexera X2 UHPLC-System. Für die Analyse wurde eine Shim-pack GISS-HP C18 mit Wasser (Milli Q) als mobile Phase verwendet. Jeder der chromatographischen Läufe hatte eine Dauer von 10 Minuten mit einer Flussrate von 0,15 mL/min und einem Injektionsvolumen von 10 μL. Für die spektrale Erfassung (Bereich 190-800 nm) wurde der SPD-M20A PDA Detektor verwendet.
Abb. 2 Chromatogramme von drei Wiederholmessungen einer Getreideprobe. In der komplexen Matrixprobe liegt die Retentionszeit des Acrylamid zwischen 4,7 und 5,1 min
Methodenentwicklung
HPLC-Methode: Für die quantitative Analyse wurde eine Kalibrationskurve mit den folgenden Konzentrationen von Acrylamid in Milli Q Wasser erstellt: 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 5 μg/mL.
Es wurde eine gute Linearität mit einem Korrelationskoeffizienten (R2) von mehr als 0,9997 erzielt. Mit diesen analytischen Bedingungen wurde die Retentionszeit von Acrylamid in einem Bereich von 4,7-5,1 min bestimmt. Bei der Analyse in einer komplexen Matrix, wie z. B. Getreide, ist die Erkennung des AA-Peaks jedoch nicht einfach. Aus diesem Grund wurden Analysen mit aufgestockten Proben durchgeführt, um die Retentionszeit von AA in der Matrix zu bestimmen. Hierfür wurden 1 mL einer 100 µg/mL AA Lösung in die Probe vor der Extraktion gespiked, um den Peak zu identifizieren. Die Wiederfindung war >65%.
Tabelle 1 HPLC-Analysenbedingungen
| System | Nexera X2 |
| Säule | Shim-pack GISS-HP C18 ((150 mm (L) x 2,1 mm (i.d.), 3 µm)) |
| Mobile Phase | Wasser (100%) |
| Flussrate | 0,15 mL/min |
| Säulentemp. | 30 °C |
| Injektionsvolumen | 10 μL |
| Detektor | SPD-M20, Messbereich: 190 nm bis 80 nm |
| Zellentemp. | 25 °C |
Abb. 4 (links) Quantifizierung einer Getreideprobe. Kalibrierkurve R2 = 0,9997. Y= 766797X -12852,6
Abb. 5 (rechts) Chromatogramm einer aufgestockten Probe
Abb. 6 UV/VIS-Absorption von Acrylamid. 3D-Grafik
Abb. 7 Vergleich einer aufgestockten Probe (braun) mit nicht aufgestockten Proben (schwarz, pink, blau) für den Nachweis des AA-Peaks.
Es wurden verschiedene Säulen getestet, um die besten Bedingungen für die Analyse zu definieren. In Abbildung 8 zeigen wir die Ergebnisse eines Vergleichs. Für die Shimadzu-Säule konnte die beste Peaksschärfe gefunden werden.
Abb. 8 Vergleich von verschiedenen Säulen
UHPLC-Methode: Für diese Analyse haben wir eine Shim-Pack-XR-ODSII mit einer Flussrate von 0,4 mL/min und einem Injektionsvolumen von 2 μl unter Verwendung desselben Systems und Detektors getestet.
Die Shim-Pack-XR-Säulen haben eine höhere Drucktoleranz (60 MPa), wodurch eine schnellere Analyse und eine bessere Auflösung der Peaks ermöglicht wird.
| System | Nexera X2 |
| Säule | Shim-pack XR-ODS II (100 mm L. x 2.0 mm I.D., 2.2 μm) |
| Mobile Phase | Wasser (100%) |
| Flussrate | 0,4 mL/min |
| Säulentemp. | 30 °C |
| Injektionsvolumen | 2 mL |
| Detektor | SPD-M20, Messbereich: 190 nm bis 80 nm |
| Zellentemp. | 25 °C |
Abb. 9 (links) Vergleich der Chromatogramme der Punkte der Kalibrierkurve. a) 2,5; b) 5; c) 10; d) 20; e) 25 μg/mL.
Abb. 10 (rechts) Kalibrierkurve Shim-pack XR-ODS II. R2 = 0.9999. Y= 56073,5X -7702,23.
Allgemeine Probenvorbereitung
Acrylamid ist sowohl in Wasser als auch in Aceton löslich. Für die Extraktion wurde hauptsächlich Aceton als Lösungsmittel gewählt, da es in der Lage ist, das AA mit minimalen Interferenzen aus der Getreidematrix zu extrahieren. Für die Extraktion wurden Aceton mit und ohne hydrophoben Lösungsmittelzusatz verwendet, um die Extraktion von Lipiden aus der Matrix zu optimieren. Nach der ersten Filtration wird die Probe abfiltriert um eine klare Aceton-Lösung zu erhalten. Nach dem Abdampfen von Aceton wird die Probe in 2 mL Wasser aufgenommen und der Analyt gelöst. Danach ist eine zweite Filtration erforderlich, um eine klare Lösung zu erhalten, die für die HPLC-Analyse geeignet ist.
Probe 10g → Erste Zugabe von Extraktionslösungsmittel (25 mL) → Ultraschallbad für 20 min → Erste Extraktion des Überstands → Zweite Zugabe von Extraktionslösungsmittel (15 mL) → Filtration des Überstands → Verdampfen des Lösungsmittels → Zugabe von 2 mL Wasser → Filtration → UHPLC/HPLC
Abb. 11 Flussdiagramm der Probenvorbereitung
Fazit
Acrylamid bildet sich unvermeidlich in Getreide während des Kochprozesses bei hoher Temperatur. Die in dieser Applikationsnote vorgestellte Analysemethode kann für die Überwachung des Acrylamidgehalts in Lebensmittelproben eingesetzt werden. Sowohl mit der kostengünsitigen HPLC-Mathode als auch mit der schnellen UHPLC-Methode kann eine empfindliche Analyse des AA bis Konzentrationen in den ppb-Bereich durchgeführt werden.
Tabelle 3 Analytische Ergebnisse
| Probe | Durchschnitt (μg/mL) | Dil. Faktor (mL) | μg / 10 g | μg / Kg |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 2,58 | 2 | 5,16 | 515,53 |
| 2 | 2,85 | 2 | 5,70 | 570,07 |
| 3 | 2,31 | 2 | 4,62 | 461,56 |
| 4 | 2,33 | 2 | 4,67 | 466,74 |
| 5 | 1,75 | 2 | 3,51 | 350,86 |
| 6 | 2,31 | 2 | 4,62 | 462,42 |
| 7 | 2,21 | 2 | 4,41 | 441,06 |
| 8 | 2,05 | 2 | 4,10 | 409,90 |
| 9 | 2,25 | 2 | 4,49 | 449,36 |
| 10 | 1,96 | 2 | 3,92 | 391,62 |
| 11 | 1,77 | 2 | 3,55 | 354,88 |
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