Das MALDI-8020 zum Screening der Sichelzellenanämie

Die Weltgesundheitsversammlung verabschiedete 2006 eine Resolution, die Sichelzellenanämie (Sickle Cell Disease = SCD) als gesundheitspolitische Priorität anzuerkennen, und rief die Länder dazu auf, die Krankheit zu bekämpfen. Diese Resolution wurde 2009 auch von den Vereinten Nationen übernommen. In diesem Zusammenhang wurden weltweit zahlreiche Screening-Programme in vielen Laboren ins Leben gerufen. SCD bezeichnet eine Gruppe erblicher Erkrankungen roter Blutkörperchen. Ursache ist anomales Hämoglobin (HbS), das durch Mutationen des Beta-Hämoglobins entsteht. Diese Krankheit wurde bereits im Jahr 1910 beschrieben. Derzeit finden sich ca. 80 % aller Fälle von Sichelzellenanämie in tropischen Regionen, insbesondere südlich der Sahara. Aufgrund von Migrationsbewegungen steigen die Zahlen aber in den letzten Dekaden auch in Europa.

Die Anforderungen der Gesundheitsschutzmaßnahmen bedienen

Screening-Programme sind Erstmaßnahmen zum Gesundheitsschutz und müssen daher auf zuverlässigen Analysemethoden und Datenverarbeitungssoftwares basieren. Wirtschaftlichkeit ist eine weitere Anforderung und hat zum Einsatz von HochdurchsatzSystemen geführt, die die Kosten der einzelnen Analysen mindern. Gleichzeitig erlauben sie durch eine größtmögliche Automatisierung, dass sich die Ärzteteams ausschließlich auf anomale Proben konzentrieren können. Das MALDI-MS (Massenspektrometer) von Shimadzu in Kombination mit Technologiepaketen des Unternehmens Biomaneo aus dem französischen Dijon begegnen diesen Herausforderungen. Sie umfassen ein Probenverarbeitungs-Kit so wie Datenverarbeitungs- und Managementsoftware.

Abbildung 1: Arbeitsablauf eines automatisierten Screenings

Zweistufiges Verfahren für genauere Ergebnisse

Screening-Programme werden üblicherweise nach einem zweistufigen Verfahren organisiert. Bei der ersten Stufe handelt es sich in der Regel um eine Routinemethode, die in der Lage sein muss, pathologische Proben auch mit nur einer einzigen Mutation nachzuweisen und sie eindeutig einer von drei Gruppen zuzuordnen: Heterozygote ohne HbS-Varianten, Heterozygote mit HbS-Varianten und HbS-Homozygote. Der zweite Schritt basiert auf einer zweiten Standard-Referenzmethode und dient dazu, die ersten Ergebnisse zu bestätigen.

Ein Screening auf Hämoglobinopathien lässt sich bei Neugeborenen durchführen, um eine frühzeitige Versorgung der Kinder zu sichern; das ermöglicht, die Lebenserwartung wesentlich zu erhöhen. Ein zweiter Screening-Anwendungsbereich betrifft Jugendliche oder Erwachsene im Zuge der Primärprävention, die es Menschen ermöglicht, ihren homozygoten AA- oder heterozygoten XS-Status zu erfahren. Menschen, die nur ein Sichelzell-Gen und ein normales Gen vererbt haben, besitzen eine Sichelzell-Veranlagung (SCT) und sind heterozygot-XS. Menschen mit SCT zeigen für gewöhnlich keine SCD-Symptome, können aber die Veranlagung auf ihre Kinder übertragen.

Effiziente Analysemethode

Das Screening Neugeborener wird üblicherweise zentral in spezialisierten Labors durchgeführt. Die hierfür verwendete biologische Probe besteht aus einem trockenen Bluttropfen auf Vliespapier.

Der Einsatz von MALDI-MS in klinischen Labors hat sich bereits bewährt, insbesondere bei der Identifikation von Mikroorganismen (beispielsweise der Einsatz von VITEK®MS). MALDI-MS-Techniken werden den Anforderungen von Screening-Anwendungen gerecht, speziell hinsichtlich Automatisierung, Empfindlichkeit, Auflösung, Stabilität, Analysegeschwindigkeit, Zuverlässigkeit und Robustheit auch bei hohen Analyseraten sowie Benutzerfreundlichkeit.

Mit der Einführung eines Screenings auf Sichelzellanämie hat Biomaneo gezeigt, dass ein Benchtop-MALDI-8020-Massenspektrometer den oben dargelegten Qualitätskriterien entspricht und den Einsatz der MALDI-MS auf Laborebene leichter, komfortabel und schnell macht.

Auflösung ist ein extrem wichtigstes Kriterium bei Analysen von Hämoglobinopathien

Betrachtet man das anomale Hämoglobin, entsteht eine SCD durch Mutationen im Beta-Hämoglobin-Gen (HbS), wodurch Glutaminsäure an Position 6 durch Valin ersetzt wird und zu einer Massenverminderung von 30 Da führt. Die erste NeoSickle-Lösung basiert auf der Analyse des gesamten Proteins, was eine ausreichende Massenauflösung bei Massen von etwa 15 kDa erfordert. Abbildung 3 zeigt das erwartete Auflösungsvermögen des MALDI-8020, um die verschiedenen Hämoglobinketten HbS, HbA und HbF nachzuweisen.

Bei diesem ersten Ansatz ist es nicht möglich, andere Varianten von Hämoglobinketten wie HbC und HbE zu trennen, die gegenüber der normalen HbA-Kette einen Massenunterschied von 1 Da aufweisen. Der zweite, von Biomaneo genutzte Ansatz besteht deshalb aus der Analyse von Peptiden der Hämoglobinketten. Auflösung und dynamischer Bereich des Benchtop-MALDI-8020 erlauben die Auftrennung der interessierenden Peptide. Abbildung 4 illustriert die Möglichkeit, Probengruppen homozygoter AA oder heterozygoter AE zu trennen.

Abbildung 3: Das erhaltene Probenspektrum aus Heterozygote AS-, Sbeta+ – und Homozygote SS mit dem Nachweis von Hämoglobin HbA- und HbS-Ketten

Empfindlichkeit und Dynamikbereich des Nachweises

Andere ausschlaggebende Kriterien beim SCD-Screening sind Empfindlichkeit und Dynamikbereich des Nachweises. Tatsächlich besitzt die Probe eines sehr früh geborenen Säuglings einen sehr niedrigen Prozentsatz, weniger als 3 % der Erwachsenen-Hämoglobinkette verglichen mit anderen Verbindungen in der Probe (fötale Beta-Hämoglobin- und Alpha-Hämoglobinkette).

MALDI-8020 ist das System der Wahl

Das MALDI-8020 erfüllt diese Kriterien mit gut kalibrierten und standardisierten Methoden. Die Bedienung des MALDI-8020 ist intuitiv, was seine rasche Integration in Laboruntersuchungen erlaubt und die Arbeit des technischen Personals erleichtert. Zu dem ist das System sehr kompakt und lässt sich leicht auf einem Labortisch unterbringen.

Der Durchsatz ist in Screening-Laboren eine zentrale Bedingung, die bei der Einführung neuer Analysemethoden berücksichtigt werden muss. Die in die Neo Sickle-Lösung eingebundene Erfassungsmethode der Spektren kombiniert mit der Leistungsfähigkeit des Benchtop-MALDI-8020 erlaubt die Analyse eines MALDI-Targets mit 48 Proben in weniger als drei Minuten. Inklusive Target-Tausch im Gerät ermöglicht dieser Durchsatz 576 Analysen pro Stunde.

Das französische Screening-Hauptlabor für SCD analysiert etwa 600 Proben täglich, d.h. über 150.000 Proben pro Jahr oder etwa 20 % aller Geburten. Weniger als sechs Analysestunden pro Tag mit einem MALDI-8020 würden ausreichen, um alle Neugeborenen in einem einzigen Labor zu screenen.

Vollständige Erfüllung der Bedürfnisse von Screening-Labors

Neben dem täglichen Durchsatz stellen die Lebensdauer des Geräts und geringe Wartungsanforderungen das letzte Kriterium dar. Um die Geräteleistung bei einer Zielsetzung von 500.000 Tests pro Jahr zu erhalten, bietet das MALDI-8020 mit TrueClean eine automatisierte Quellenreinigung. So lässt sich die Extraktionselektrode in-situ reinigen, ohne das Gerätevakuum zu brechen; es handelt sich um ein automatisiertes und rasches (<10 min) UVLaser- basiertes Verfahren. Darüber hinaus minimiert eine Ionenoptik mit weiter Öffnung das Risiko der Quellenverschmutzung im Laufe der Zeit und sorgt damit für eine stabile Plattform.

Diese Charakteristiken und Ergebnisse zeigen die Eignung des Benchtop-MALDI-8020-Massenspektrometers für den Nachweis von Hämoglobinopathien beziehungsweise für Hochdurchsatz-Analysen komplexer Blutproben. Es erfüllt sehr klar die Bedürfnisse von Screening-Laboren.

Leistung und Geschwindigkeit der MALDI-Geräte bedeutet, dass sie nur in sehr wenigen Ausnahmefällen ausschließlich für eine einzelne Anwendung eingesetzt werden. Für Kliniken oder Labore ist es effektiv, die in diese Technologien gemachten Investitionen optimal zu nutzen. Daher ist die Systemvielseitigkeit ein wichtiges finanzielles Kriterium, das in Betracht zu ziehen ist. Für Labore mit einer geringen Zahl an Screening-Analysen liegt der Vorteil eines MALDI-8020 im Management der Erfassungsparameter, denn die Akquisitionsmethoden fassen alle für die Gerätekontrolle notwendigen Parameter zusammen. Das macht ein MALDI-8020 für vielfache Anwendungen einsetzbar, ohne das Risiko Individualanalysen zu stören.

Fazit

Die Erfassungsgeschwindigkeit und die Einfachheit eines Verfahrenswechsels macht das Benchtop-MALDI-8020 ideal für viele Anwendungen und zu einem unverzichtbaren Messgerät für biochemische Labore. Im Zusammenhang mit dem SCD-Screening erfüllt ein MALDI-8020 alle Erfordernisse. Dieses kompakte, einfach einsetzbare und hoch leistungsfähige Instrument ist für die meisten Screening-Anwendungen geeignet.

NeoSickle® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Biomaneo.
NeoScreening® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Biomaneo.