Tocopherol (Vitamin E)-Analyse in Vaping E-Liquid durch UHPLC-PDA
Einführung
Krankheiten, die durch den Konsum von E-Zigaretten resultieren sind laut einer Statistik des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ein stetig wachsendes Problem. Bisher sind über 2000 Fälle und 39 Todesfälle in den USA bekannt (CDC – November 2019). Bislang ist unklar was die Krankheiten verursacht, aber Vitamin E-Acetat wurde als ein möglicher Mitverursacher identifiziert. Vitamin E-Acetat wurde in der bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit (BAL) bei allen derzeit von der CDC getesteten Proben gefunden (CDC – November 2019).
In dieser Applikationsnote werden zwei neu entwickelte Methoden vorgestellt, die mit Hilfe eines Photodiodearray (PDA) Detektor drei Isomere von Tocopherol (Vitamin E) trennen: Alpha-Tocopherol-Acetat, Alpha-Tocopherol und Gamma-Tocopherol. In der ersten Methode wird die Matrix und das Nikotin der sogenannten „E-Liquids“ in einer 10 minütigen Methode von den Cannabinoiden und Vitamin E-Isomeren getrennt. Zweitens wurde ebenfalls eine 5-Minuten-Schnellmethode mit voller Grundlinienauflösung zur Identifizierung und quantitativen Analyse der drei Vitamin-E-Isomere entwickelt, jedoch ohne Auflösung zwischen Matrix, Nikotin und den Cannabinoiden.
Für die Methodenentwicklung wurde das Nexera XR UHPLC-System mit dem PDA-Detektor verwendet. Zusammen mit einem Core-Shell Säulenmaterial ermöglicht die Nexera XR eine schnelle Trennung der Proben bei geringem Gegendruck und einer sehr hohen Trennungseffizienz. Der PDA nimmt bei dieser Applikation eine tragende Rolle ein, da mit diesem Detektor drei Wellenlängenkanäle simultan gemessen werden können: 290 nm für Vitamin-E-Isomere, 260 nm für Nikotin und 228 nm für Cannabinoide.
Analytische Bedingungen
Tabelle 1: Parameter der Instrumentenmethode (10-Minuten-Methode)
| Flüssigchromatographie | Nexera XR mit PDA |
|---|---|
| Mobile Phase A | Wasser, 0,1% Ameisensäure |
| Mobile Phase B | 1:1 Methanol/Acetonitril |
| Zusammensetzung der mobilen Phase | Konzentration B innerhalb von 1,5 min von 70% auf 95% fahren, Konzentration B für 6,5 Minuten halten |
| Säule | Shim-Pack Velox C18, 1,8 μm, 3,0 x 100 mm; Shim-Pack Velox EXP-Guard, 3,0 x 5 mm |
| Ofentemperatur | 40°C |
| Flussrate | 0,8 mL/min |
| Überwachte Wellenlängen | 290 nm, 260 nm, 228 nm |
| Laufzeit | 10 Minuten |
Tabelle 2: Parameter der Instrumentenmethode (5-Minuten-Methode)
| Flüssigchromatographie | Nexera XR mit PDA |
|---|---|
| Mobile Phase A | Wasser, 0,1% Ameisensäure |
| Mobile Phase B | 1:1 Methanol/Acetonitril |
| Zusammensetzung der mobilen Phase | Isokratisch, 5:95 |
| Säule | Shim-Pack Velox C18, 1,8 μm, 3,0 x 100 mm; Shim-Pack Velox EXP-Guard, 3,0 x 5 mm |
| Ofentemperatur | 40°C |
| Flussrate | 0,8 mL/min |
| Überwachte Wellenlängen | 290 nm, 260 nm, 228 nm |
| Laufzeit | 5 Minuten |
Standard-Vorbereitung
Für diese Anwendung wurden drei Formen von Tocopherol (Vitamin E) verwendet. Eine Lösung von Gamma-Tocopherol (Gamma-Vitamin E) mit 1,0 mg/mL wurde von Sigma-Aldrich/Cerilliant gekauft. Für Alpha-Tocopherol (Alpha-Vitamin E) und Alpha-Tocopherol-Acetat (Alpha-Vitamin E-Acetat) wurden jeweils saubere Standards (100 mg) von Sigma-Aldrich gekauft. Vitamin E-Standards wurden in 6 Kalibrierstufen 100, 50, 25, 10, 5 und 1 ppm in Methanol hergestellt.
Die Nikotin- und Cannabinoidmischung wurde als kombinierte 50 ppm-Lösung hergestellt. Diese Mischung wurde als Co-Injektionsstandard mit den Vitamin-E-Standards verwendet, um die Trennung der Vitamin-E-Analyten von den Nikotin- und Cannabinoiden nachzuweisen. Die Co-Injektion ist ein benutzerfreundliches Pretreatmentprogramm im Autosampler, welches eine automatische Verdünnung verschiedener Proben ermöglicht. Die Standardkonzentrationen werden hierfür durch den Anwender vorher definiert. Die 3-Komponenten-Cannabinoidmischung (CBD, d9-THC und CBN) wurde von Restek und der Nikotinstandard 1,0 mg/mL von Sigma-Aldrich bezogen.
Probenvorbereitung
Die E-Liquid-Extraktion wurde mit einer etwa 500 mg-Probe durchgeführt, die in 5 mL Isopropylalkohol extrahiert und durch Vortex vermischt wurde. Weitere 5 mL Methanol wurden der extrahierten Probe hinzugefügt und weiter durch Vortexen gemischt. Dann wurden 500 μL dieser Mischung in 500 μL Methanol verdünnt (2-fache Verdünnung). 200 μL der endgültig verdünnten Probe wurden mit einem 0,2 µm PTFE-Filter in ein HPLC-Vial filtiert. Die Proben E und F wurde nach einer ähnlichen Probenvorbereitung behandelt, jedoch erfolgte eine 5-fache Verdünnung vor der Filtration.
| Probe | CBD oder Nikotin | Etikettangabe | Geschmack | Zutaten |
|---|---|---|---|---|
| A – E-liquid | Nikotin | 3 mg/mL | Blue Raspberry | Unbekannt, VG (pflanzliches Glyzerin) |
| B – E-liquid | Nikotin | 6 mg/mL | Really Berry | Pflanzliches Glycerin, Propylenglykol, Aromen, Nikotin |
| C – E-liquid | CBD | 100 mg | Blue Raspberry-Dragon Fruit | Natürliches Cannabidiol, Propylenglykol, pflanzliches Glycerin in Lebensmittelqualität, natürliche und künstliche Aromen |
| D – E-liquid | CBD | 100 mg | Lava Flow | Aus organischem Hanf gewonnenes CBD, Koscheres pflanzliches Glyzerin, MCT-Öl, Geschmackskonzentrate |
| E – E-liquid | CBD | 250 mg | Lemon-Lime | Vollspektrum-Cannabidiol-Mischung, natürlicher Zitronen-Limetten-Extrakt und Kokosnussöl |
| F-Kokosnussöl | - | - | - | MCT-Kokosnussöl 100 |
Ergebnisse und Diskussion
Methodenentwicklung
Die 10-minütige Methode verwendet einen Gradientenfluss, um eine Trennung der E-Liquid-Matrix, dem Nikotin, dem Cannabinoiden und der Vitamin E-Isomere zu erzielen. Abbildung 1 zeigt die chromatographische Trennung der Vitamin-E-Isomere ab etwa 5,5 Minuten (schwarz), der Cannabinoide ab etwa 2 Minuten (blau) und des Nikotins ab etwa 0,5 Minuten (rosa). Die E-Liquid-Matrix eluiert ebenfalls in der Nähe von Nikotin (siehe Abbildung 4).
Drei verschiedene Wellenlängen wurden für die verschiedenen Komponenten des E-Liquids auf der Grundlage des λ max aus den jeweiligen Absorptionsspektren bestimmt. Die Wellenlänge 290 nm wird für die Vitamin-E-Isomere verwendet, 228 nm für Cannabinoide und 260 nm für Nikotin (Abbildung 1).
Abbildung 1 zeigt, dass die Vitamin-E-Isomere auch in den Chromatogrammen B und C bei den niedrigeren Wellenlängen in der Nähe von 5,5 Minuten absorbieren. Es wird nicht empfohlen, die Wellenlängen 228 nm und 260 nm für die Vitamin-E-Bestimmung zu verwenden, da einige der E-Liquid-Proben unbekannte Analyten enthalten, die eine ähnliche Retentionszeit wie Alpha-Vitamin E haben und bei den niedrigeren Wellenlängen absorbieren (Abbildung 4). Diese Unbekannten absorbieren nicht bei den höheren Wellenlängen. Aus diesem Grund wird die Wellenlänge bei 290 nm für die Vitamin E-Bestimmung verwendet, um eine falsch positive Identifizierung zu vermeiden.
Die 5-Minuten-Methode wurde als isokratische Methode entwickelt, die als schnelle Screeningmethode verwendet werden kann, um festzustellen, ob Vitamin E in den E-Liquids vorhanden ist. Die drei Vitamin-E-Isomere werden vollständig von den anderen Probenbestandteilen getrennt, aber die E-Liquid-Matrix, Cannabinoide und/oder Nikotin werden nicht vollständig aufgelöst (Abbildung 2).
Abbildung 1: Vitamin-E-Isomere bei verschiedenen Wellenlängen (10-Minuten-Methode)
Abbildung 2: Vitamin-E-Isomere bei verschiedenen Wellenlängen (5-Minuten-Methode)
Kalibrierung
Abbildung 3 zeigt den Vergleich der Vitamin-E-Isomere bei verschiedenen Konzentrationen mit Kalibrationspunkten sowohl für die 10- als auch für die 5-Minuten-Methode. Die Kalibrationskurven der sechs Standards (100 – 1 ppm) der drei Tocopherol-Isomere haben sowohl bei der 10- als auch bei der 5-Minuten-Methode einen R2-Wert von mindestens 0,999 (Tabelle 4). Die Genauigkeiten der berechneten Konzentration liegen bei +/- 5%.
Abbildung 3: Chromatogramme der Kalibrationsstandards und Kalibrationskurven von Tocopherol-Isomeren
Tabelle 4: Ergebnisse der Kalibration der Vitamin-E-Isomere (5-Minuten-Methode)
| 10-Minuten-Methode | Gamma-Vitamin E | Alpha-Vitamin E | Alpha-Vitamin-E-Acetat |
| Retentionszeit | 5,682 | 6,364 | 7,727 |
| R2 | 0,9997766 | 0,9998797 | 0,9999021 |
| 5-Minuten-Methode | |||
| Retentionszeit | 2,686 | 3,191 | 4,223 |
| R2 | 0,9998746 | 0,9999525 | 0,9998544 |
Probenergebnisse
Mit der neuen Methode zur Analyse von Vitamin E wurden sechs E-Liquid-Proben analysiert. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4 unten zusammengefasst. Die drei Wellenlängenspuren sind überlagert dargestellt (schwarz – 290 nm, rosa – 260 nm und blau – 228 nm). Die Proben A und B zeigen Ergebnisse der Nikotinelution in der Nähe der Probenmatrix. Diese Peaks eluieren ebenfalls sehr früh in der Chromatographie, was darauf hinweist, dass sie auf der Säule nicht zurückgehalten werden.
Die Proben C, D und E weisen alle deutliche Peaks für die E-Liquid-Matrix und das CBD-Cannabinoid auf. CBD, d9-THC und CBN zeigen eine Retention auf der Säule, sollten aber nicht zur Quantifizierung verwendet werden, da andere Cannabinoide vorhanden sein könnten, die in dieser Standardmischung nicht verwendet werden. Diese Methoden wurden nicht für die Quantifizierung von Nikotin und Cannabinoiden entwickelt, können aber qualitativ für die Produktbestimmung verwendet werden.
Abbildung 4: E-Liquid-Proben (Nikotin – rosa, Cannabinoide – blau, Vitamin E-Isomere – schwarz)
Vitamin E wurde mit der Methode aus dieser Anwendung in keiner der Proben nachgewiesen. Die E-Flüssigkeit, die Kokosnussöl (Probe E) als Verdickungsmittel verwendete, wies jedoch unbekannte Komponenten auf, die bei niedrigen Wellenlängen (nahe 228 nm) absorbieren. Kokosnussöl (Probe F) wurde ebenfalls unter denselben Bedingungen analysiert, und die Chromatogrammüberlagerung mit der E-Liquid-Probe (Probe E) ist unten in Abbildung 5 zu sehen.
Bei 290 nm (Abbildung 5 – links) sind diese unbekannten Komponenten nicht zu sehen, aber bei 228 nm (Abbildung 5 – rechts) finden sich sowohl in Probe E als auch in Kokosnussöl mehrere Verbindungen mit identischer Retentionszeit. Dies zeigt, warum es nicht empfohlen wird, 228 nm als Wellenlänge für die Vitamin-E-Bestimmung zu verwenden, da falsch positive Ergebnisse möglich sein könnten.
Abbildung 5: E-Liquid-Probe mit 250 mg CBD (Probe F). Kokosnussöl und 50 ppm Vitamin-E-Isomerengemisch
Fazit
Die in dieser Applikation beschriebenen Methoden können als Screening-Methoden für drei Vitamin-E-Isomere in Nikotin- oder Cannabinoid-haltigen E-Liquid-Produkten verwendet werden. Die 5-Minuten-Schnellmethode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Vitamin E, während die 10-Minuten-Methode auch die Bestimmung zwischen Produkten auf Nikotin- oder Cannabinoidbasis ermöglicht.
Consumables
- Shim-pack Velox C18, 1.8 μm, 3.0 x 100 mm (220-32008-02)
- Shim-pack Velox EXP Guard, 3.0 x 5 mm (220-32028-02)
- Restek Cannabinoid Standards – 3 components (Cat.# 34014) oder Shimadzu 11-Component Cannabinoid Standard (220-91239-21)
- 0.2 μM PTFE Filter vials (220-91521-40)
Quelle
(2019) Outbreak of Lung Injury Associated with the Use of E-cigarette, or Vaping, Products. https://www.cdc.gov